Роль вставочной петли вокруг триптофана 148 в активности тромбина
The role of the insertion loop around tryptophan 148 in tthe activity of thrombin.
Экспериментальное лабораторное исследование (биохимия) в журнале Biochemistry (1996)
Аннотация
Thrombin has trypsin-like specificity for Arg-Xaa and Lys-Xaa peptide bonds; however, it is much more specific than trypsin, cleaving far fewer peptide bonds in macromolecular substrates. To probe the nature of the specificity of thrombin, a mutant has been constructed in which the Trp148 loop of thrombin has been replaced with the same loop of bovine trypsin. This mutant was expressed in Escherichia coli as prethrombin-2(148) using a T7 expression system previously described for wild-type prethrombin-2 [DiBella et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 163-169]. After refolding and purification, prethrombin-2(148) was activated to thrombin(148) with Echis carinatus snake venom. The k(cat)/K(m) for the release of fibrinopeptide A from fibrinogen was 4.5 +/- 0.5 microM(-1)s(-1) for thrombin(148), which was approximately 20% of that of recombinant thrombin (25 +/- 2.0 microM(-1)s(-1)). Thrombin(148) was inhibited less well by hirudin with a K(i) of 500 pM compared to a value of 12 pM determined for recombinant thrombin. The mutant thrombin was also compared to trypsin and wild-type recombinant thrombin for the ability to cleave small peptide substrates. The Michaelis constants (K(m)) were found to be between 5- and 10-fold higher for thrombin(148) relative to wild-type recombinant thrombin, although the catalytic constants (k(cat)) for thrombin(148) and recombinant thrombin remained relatively unchanged for all three substrates. Thrombin(148) had a specificity constant (k(cat)/K(m)) 2-fold higher for the hydrolysis of H-D-phenyalanyl-L- pipecolyl-L-arginine-p-nitroaniline (a thrombin substrate) than that of trypsin. For N-benzoyl-L-isoleucyl-L-glutamylglycyl-L-arginine- p-nitroaniline (a trypsin substrate) and N-carbobenzoxyglycylprolyl-L-arginine-p-nitroaniline (a substrate for both enzymes), the specificity constants for trypsin were 1000- and 16-fold higher, respectively. Although replacement of the Trp(148) loop does not yield an enzyme with more trypsin-like specificity, the Trp(148) loop is important in the substrate binding and specificity of thrombin (on the basis of K(m) and K(i)).
Аннотация взята из PubMed (NCBI) для цитируемой записи и приводится на языке оригинала. Авторитетной является версия в исходной публикации.
Аннотация оставлена без перевода, чтобы сохранить собственные формулировки авторов.
Резюме
Сконструирован мутант тромбина, в котором Trp148-петля заменена на соответствующую петлю бычьего трипсина; мутант экспрессирован в Escherichia coli в виде претромбина-2 и активирован ядом Echis carinatus. Константа специфичности kcat/Km для отщепления фибринопептида А составила 4,5 ± 0,5 мкМ⁻¹с⁻¹ (≈20% от рекомбинантного тромбина дикого типа, 25 ± 2,0 мкМ⁻¹с⁻¹), а ингибирование гирудином было существенно слабее (Ki 500 пМ против 12 пМ). Авторы заключают, что Trp148-петля важна для связывания субстратов и специфичности тромбина, хотя её замена не делает фермент более трипсин-подобным.
Почему это важно для гирудотерапии
DiBella и соавт. (1996, Biochemistry) исследовали субстратную специфичность тромбина, сконструировав мутант, в котором вставочная петля Trp148 тромбина была заменена соответствующей петлёй бычьего трипсина; мутант в целом сохранил тромбиноподобную специфичность, но показал изменённую кинетику и, что примечательно, ингибировался hirudin гораздо хуже (Ki ~500 пМ), чем рекомбинантный тромбин (Ki ~12 пМ), что указывает на роль петли Trp148 в связывании субстрата и специфичности. Для ASH это фундаментальная биохимия, лежащая в основе истории пиявочного антикоагулянта: hirudin, характерный ингибитор тромбина медицинской пиявки, используется здесь как молекулярный зонд, и резкая потеря ингибирования при замене петли помогает картировать, как hirudin распознаёт и блокирует тромбин — основу антикоагуляции пиявочного происхождения. Честная оговорка: это исследование по энзимологии/белковой инженерии in vitro с использованием рекомбинантных белков, а не клиническое или даже на животных исследование гирудотерапии, и данные по hirudin являются механистическим показателем, а не доказательством терапевтического эффекта.
Связанные соединения в реестре ASH
Молекулы из пиявки и препараты на основе гирудина, связанные с темой данной статьи; у каждого есть полный профиль в реестре соединений ASH:
Цитирование
The role of the insertion loop around tryptophan 148 in tthe activity of thrombin.
DiBella et al. · Biochemistry, 1996
Связанный клинический контекст
Узнайте, как это исследование связано с клинической практикой
Похожие исследования
Другие рецензируемые исследования в разделе «Разработка лекарственных препаратов».
- Novel Leech Antimicrobial Peptides — Hirunipins — Kumar et al. (2025)
- Medicinal Leech Draft Genome — Anticoagulant Gene Survey — Kvist S, Manzano-Marín A, de Carle D, Trontelj P, Siddall ME (2020)
- Влияние гирудотерапии на функции печени, липидный профиль и чувствительность к инсулину у крыс с метаболическим синдромом — Bilden A et al. (2026)
- Гирудотерапия в медицине и стоматологии — Jha K et al. (2015)
- Лечение медицинскими пиявками (гирудотерапия): краткий обзор — Singh A (2010)
- Гирудотерапия при ранней пресбиакузии у ликвидаторов аварии на Чернобыльской АЭС в поставарийные годы — Zabolotnyi D, Mishchanchuk N (2019)
- Изучение оксидантно-антиоксидантного статуса у пациентов, получавших гирудотерапию: экспериментальное исследование — Sarikan I, Savas H (2024)
- Терапевтическое применение пиявок — Abdualkader A et al. (2013)
- Неокклюзионная мезентериальная ишемия, вызванная гирудотерапией: клинический случай — Akalın Ç, Ekmen N (2020)
- Лечение пиявками: история — Hyson J (2005)
Добавлено в библиотеку ASH: 28 мая 2026 г. · Последнее обновление сайта: 18 июня 2026 г.