Biotechnologische Herstellung rekombinanter Analoga von Hirudin-1 aus Hirudo medicinalis

Hirudin-1 is a highly selective inhibitor of thrombin secreted by salivary glands of the medicinal leech Hirudo medicinalis. This direct anticoagulant is used for the treatment and prevention of disorders in blood coagulation system. Apart from the existing recombinant analog of hirudin-1 (63-desulfatohirudin-1, desirudin) its modified analogs possessing higher activity and stability are of medical value. In this study artificial genes of hirudin and two its analogs (hirudin-1, [Leu1, Thr2]-hirudin-1 and [Leu1, Thr2]-hirudin-1/3) were synthesized and cloned in an expression vector pTWIN1 in frame with the gene of mini-intein SspDnaB from Synechocystis sp. Producing strains of the corresponding fusion proteins were constructed using E. coli strain ER2566. Biotechnological schemes for the production of 63-desulfatohirudin-1 and its analogs were developed. The scheme includes the following stages: isolation of the fusion protein after the desintegration of the cell biomass, refolding of the target peptide within the fusion protein, pH-inducible cleavage of the fusion protein, and chromatographic purification of the target product. Antithrombotic activity of the obtained peptides was determined by a standard amidolytic assay. The developed methods for the production of 63-desulfatohirudin-1, [Leu1, Thr2]-desulfatohirudin-1 [Leu1, Thr2]-desulfatohirudin-1/3 allowed to obtain these peptides with high yields (14, 25 and 24 mg per liter of cell culture respectively) and high activity (13423, 33333 and 19802 ATU/mg respectively).

Abstract aus PubMed (NCBI) für den zitierten Eintrag, in der Originalsprache wiedergegeben. Maßgeblich ist die Fassung der Originalpublikation.

Das Abstract wird nicht übersetzt, damit die eigene Wortwahl der Autoren erhalten bleibt.

Hirudin-1, ein hochselektiver Thrombininhibitor aus den Speicheldrüsen von Hirudo medicinalis, dient als direktes Antikoagulans. Künstliche Gene für Hirudin-1 und zwei Analoga wurden in E. coli als Fusionsproteine mit Mini-Intein exprimiert; das Verfahren umfasst Isolierung, Refolding, pH-induzierte Spaltung und chromatographische Reinigung. Die Peptide 63-Desulfatohirudin-1, [Leu1, Thr2]-Desulfatohirudin-1 und [Leu1, Thr2]-Desulfatohirudin-1/3 wurden mit hohen Ausbeuten (14, 25 bzw. 24 mg pro Liter Zellkultur) und hoher Aktivität (13 423, 33 333 bzw. 19 802 ATU/mg) gewonnen.

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