Herstellung, Aufreinigung und Charakterisierung eines neuartigen cysteinreichen Antikoagulans aus dem medizinischen Blutegel und die funktionelle Rolle seines C-terminalen Motivs

The saliva of the medicinal leech Hirudo medicinalis contains a wide range of biologically active compounds, including multiple anticoagulants. Previously, we identified a novel cysteine-rich anticoagulant protein (CRA) from leech saliva and produced it recombinantly in Escherichia coli, demonstrating its potential as a basis for new anticoagulant drugs. In this study, we developed an optimized procedure for scalable production and purification of recombinant CRA. The purified protein was analyzed for common contaminants originating from E. coli, such as endotoxins, bacterial proteins, and DNA, and its anticoagulant properties were evaluated using standard clotting assays. Across three independent experiments, the yield of purified CRA ranged from 3.7 to 5.5 mg per liter of bacterial culture, with impurity levels per milligram of protein ranging from 7.1-31.2 ng of bacterial proteins, 1.2-15.1 ng of DNA, and 60-1445 EU of endotoxins. The purified CRA displayed electrophoretic and chromatographic homogeneity and retained strong anticoagulant activity. Additionally, a truncated form of CRA lacking the C-terminal region was produced and characterized. This variant lost membrane affinity and showed altered activity profiles, with higher thrombin time activity but reduced prothrombin time and activated partial thromboplastin time activities compared with the full-length protein.

Abstract aus PubMed (NCBI) für den zitierten Eintrag, in der Originalsprache wiedergegeben. Maßgeblich ist die Fassung der Originalpublikation.

Das Abstract wird nicht übersetzt, damit die eigene Wortwahl der Autoren erhalten bleibt.

Das cysteinreiche Antikoagulans CRA aus dem Speichel von Hirudo medicinalis wurde rekombinant in Escherichia coli hergestellt; nun wird ein optimiertes, skalierbares Produktions- und Reinigungsverfahren beschrieben. In drei unabhängigen Experimenten betrug die Ausbeute 3,7–5,5 mg pro Liter Bakterienkultur bei 7,1–31,2 ng bakteriellen Proteinen, 1,2–15,1 ng DNA und 60–1445 EU Endotoxinen je mg Protein. Das gereinigte CRA war homogen und behielt seine starke antikoagulatorische Aktivität; eine Variante ohne die C-terminale Region verlor Membranaffinität und zeigte erhöhte Thrombinzeit-, aber verminderte Prothrombinzeit- und aPTT-Aktivität.

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