Klonierung, Charakterisierung und heterologe Expression eines Kandidaten-Hirudin-Gens aus dem Speicheldrüsentranskriptom von Hirudo nipponia

Hirudin is a pharmacologically active substance in leeches with potent blood anticoagulation properties. Although recombinant hirudin production isolated from Hirudo medicinalis Linnaeus and Hirudinaria manillensis Lesson is known, to our knowledge, this study is the first to report recombinant hirudin expression and production from Hirudo nipponia Whitman. Thus, the present study aimed to clone and characterize the full-length cDNA of a candidate hirudin gene (c16237_g1), which is localized on the salivary gland transcriptome of H. nipponia, and further evaluate its recombinant production using a eukaryotic expression system. The 489-bp cDNA possessed several properties of the hirudin "core" motifs associated with binding to the thrombin catalytic pocket. A fusion expression vector (pPIC9K-hirudin) was constructed and successfully transformed into Pichia pastoris strain GS115 via electroporation. Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis and western blot analysis confirmed hirudin expression. The recombinant protein was expressed with a yield of 6.68 mg/L culture. Mass spectrometry analysis further confirmed target protein expression. The concentration and antithrombin activity of purified hirudin were 1.67 mg/mL and 14,000 ATU/mL, respectively. These findings provide a basis for further elucidating the molecular anticoagulation mechanism of hirudin, and address China's growing market demand for engineered H. nipponia-derived hirudin and hirudin-based drugs.

Abstract aus PubMed (NCBI) für den zitierten Eintrag, in der Originalsprache wiedergegeben. Maßgeblich ist die Fassung der Originalpublikation.

Das Abstract wird nicht übersetzt, damit die eigene Wortwahl der Autoren erhalten bleibt.

Nach Kenntnis der Autoren ist dies der erste Bericht über rekombinantes Hirudin aus Hirudo nipponia. Aus dem Speicheldrüsentranskriptom wurde die 489-bp-cDNA des Kandidatengens c16237_g1 mit «Core»-Motiven für die Thrombinbindung kloniert und als pPIC9K-Hirudin-Vektor in Pichia pastoris GS115 elektroporiert. SDS-PAGE, Western-Blot und Massenspektrometrie bestätigten das rekombinante Protein (Ausbeute 6,68 mg/L Kultur); gereinigt erreichte es 1,67 mg/ml mit 14 000 ATU/ml Antithrombinaktivität. Die Autoren sehen darin eine Grundlage zur Aufklärung des Wirkmechanismus und zur Deckung der wachsenden chinesischen Nachfrage nach Hirudin.

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