Funktionelles Phagen-Display des vom Blutegel stammenden Tryptase-Inhibitors (LDTI): Konstruktion einer Bibliothek und Selektion von Thrombininhibitoren

The recombinant phage antibody system pCANTAB 5E has been used to display functionally active leech-derived tryptase inhibitor (LDTI) on the tip of the filamentous M13 phage. A limited combinatorial library of 5.2 x 10(4) mutants was created with a synthetic LDTI gene, using a degenerated oligonucleotide and the pCANTAB 5E phagemid. The mutations were restricted to the P1-P4' positions of the reactive site. Fusion phages and appropriate host strains containing the phagemids were selected after binding to thrombin and DNA sequencing. The variants LDTI-2T (K8R, I9V, S10, K11W, P12A), LDTI-5T (K8R, I9V, S10, K11S, P12L) and LDTI-10T (K8R, I9L, S10, K11D, P12I) were produced with a Saccharomyces cerevisiae expression system. The new inhibitors, LDTI-2T and -5T, prolong the blood clotting time, inhibit thrombin (Ki 302 nM and 28 nM) and trypsin (Ki 6.4 nM and 2.1 nM) but not factor Xa, plasma kallikrein or neutrophil elastase. The variant LDTI-10T binds to thrombin but does not inhibit it. The relevant reactive site sequences of the thrombin inhibiting variants showed a strong preference for arginine in position P1 (K8R) and for valine in P1' (I9V). The data indicate further that LDTI-5T might be a model candidate for generation of active-site directed thrombin inhibitors and that LDTI in general may be useful to generate specific inhibitors suitable for a better understanding of enzyme-inhibitor interactions.

Abstract aus PubMed (NCBI) für den zitierten Eintrag, in der Originalsprache wiedergegeben. Maßgeblich ist die Fassung der Originalpublikation.

Das Abstract wird nicht übersetzt, damit die eigene Wortwahl der Autoren erhalten bleibt.

Der vom Blutegel stammende Tryptase-Inhibitor LDTI wurde funktional auf M13-Phagen präsentiert. Aus einer Bibliothek von 5,2 × 10⁴ Mutanten, deren Veränderungen auf die Positionen P1 bis P4' beschränkt waren, wurden nach Thrombinbindung Varianten selektiert. LDTI-2T und LDTI-5T verlängerten die Gerinnungszeit und hemmten Thrombin (Ki 302 bzw. 28 nM) sowie Trypsin (Ki 6,4 bzw. 2,1 nM), nicht jedoch Faktor Xa, Plasma-Kallikrein oder neutrophile Elastase. Laut Autoren könnte LDTI-5T ein Modellkandidat für auf das aktive Zentrum gerichtete Thrombininhibitoren sein.

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