Messung der Geschwindigkeitskonstanten der reversiblen Bildung und der irreversiblen Umlagerung des Elastase-α1-Proteinaseinhibitor-Komplexes mittels Stopped-Flow-Fluoreszenzenergietransfer

Serpins are thought to inhibit proteinases by first forming a Michaelis-type complex that later converts into a stable inhibitory species. However, there is only circumstantial evidence for such a two-step reaction pathway. Here we directly observe the sequential appearance of two complexes by measuring the time-dependent change in fluorescence resonance energy transfer between fluorescein-elastase and rhodamine-alpha1-protease inhibitor. A moderately tight initial Michaelis-type complex EI1 (Ki = 0.38-0.52 microM) forms and dissociates rapidly (k1 = 1.5 x 10(6) M-1 s-1, k-1 = 0.58 s-1). EI1 then slowly converts into EI2 (k2 = 0.13 s-1), the fluorescence intensity of which is stable for at least 50 s. The two species differ by their donor-acceptor energy transfer efficiency (0. 41 and 0.26, respectively). EI2 might be the final product of the elastase + inhibitor association because its transfer efficiency is the same as that of a complex incubated for 30 min. The time-dependent change in fluorescence resonance energy transfer between fluorescein-elastase and rhodamine-eglin c, a canonical inhibitor, again allows the fast formation of a complex to be observed. However, this complex does not undergo any fluorescently detectable transformation.

Abstract aus PubMed (NCBI) für den zitierten Eintrag, in der Originalsprache wiedergegeben. Maßgeblich ist die Fassung der Originalpublikation.

Das Abstract wird nicht übersetzt, damit die eigene Wortwahl der Autoren erhalten bleibt.

Die Autoren maßen den zeitabhängigen Fluoreszenzenergietransfer zwischen Fluoreszein-Elastase und Rhodamin-α1-Proteinaseinhibitor, um die zweistufige Hemmung durch Serpine direkt zu beobachten. Zuerst bildete sich ein Michaelis-Komplex EI1 (Ki = 0,38–0,52 µM; k1 = 1,5 × 10⁶ M⁻¹ s⁻¹, k−1 = 0,58 s⁻¹), der langsam in EI2 (k2 = 0,13 s⁻¹) überging; dessen Fluoreszenz blieb mindestens 50 s stabil, mit geänderter Transfereffizienz (0,41 vs. 0,26). EI2 könnte das Endprodukt sein; mit Eglin c bildete sich rasch ein Komplex ohne fluoreszenzmessbare Umwandlung.

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