Ein Großfragmentansatz zur DNA-Synthese: Totalsynthese eines Gens für den Proteaseinhibitor Eglin c aus dem Blutegel Hirudo medicinalis und seine Expression in E. coli

A DNA containing the coding sequence for the proteinase inhibitor protein, eglin c, from the leech Hirudo medicinalis has been obtained by enzymatic assembly of chemically synthesized DNA fragments. The synthetic gene consists of a 232 base-pair fragment containing initiation and termination codon signals with restriction enzyme recognition sites conveniently placed for cloning into a plasmid vector. Only six oligonucleotides from 34 to 61 bases in length, sharing pairwise stretches of complementary regions at their 3'-termini, were prepared by phosphotriester solid-phase synthesis. The oligomers were annealed pairwise and converted into double stranded DNA fragments by DNA polymerase I mediated repair synthesis. The fragments were assembled by ligation, and the synthetic gene was expressed in high yield in E. coli under the transcriptional control of the E. coli tryptophan promoter. The expression product was purified to homogeneity and was shown to have similar physicochemical and identical biological properties as the authentic protein isolated from the leech.

Abstract aus PubMed (NCBI) für den zitierten Eintrag, in der Originalsprache wiedergegeben. Maßgeblich ist die Fassung der Originalpublikation.

Das Abstract wird nicht übersetzt, damit die eigene Wortwahl der Autoren erhalten bleibt.

Durch enzymatische Assemblierung chemisch synthetisierter DNA-Fragmente wurde das Gen für den Proteinaseinhibitor Eglin c aus Hirudo medicinalis als 232-bp-Fragment mit Start- und Stoppcodon sowie Restriktionsschnittstellen hergestellt. Sechs 34–61-Basen-Oligonukleotide mit paarweise komplementären 3'-Enden wurden mittels Phosphotriester-Festphasensynthese hergestellt, hybridisiert und durch DNA-Polymerase-I-Reparatursynthese in doppelsträngige DNA überführt. Nach Ligation wurde das Gen unter dem E.-coli-Tryptophan-Promotor in hoher Ausbeute exprimiert; das gereinigte Produkt wies ähnliche physikochemische und identische biologische Eigenschaften wie das authentische Protein aus dem Blutegel auf.

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