Die variable Region 1 des Gewebe-Plasminogenaktivators verleiht Thrombin Spezifität für den Plasminogenaktivator-Inhibitor-1 durch Förderung der Katalyse: Aufhebung einer kinetischen Blockade durch eine heterologe Protein-Oberflächenschleife

Substitution of the native variable region-1 (VR1/37-loop) of thrombin by the corresponding VR1 of tissue-type plasminogen activator (thrombin-VR1(tPA)) increases the rate of inhibition by plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1) by three orders of magnitude, and is thus sufficient to confer PAI-1 specificity to a heterologous serine protease. A structural and kinetical approach to establish the function of the VR1 loop of t-PA in the context of the thrombin-VR1(tPA) variant is described. The crystal structure of thrombin-VR1(tPA) was resolved and showed a conserved overall alpha-thrombin structure, but a partially disordered VR1 loop as also reported for t-PA. The contribution of a prominent charge substitution close to the active site was studied using charge neutralization variants thrombin-E39Q(c39) and thrombin-VR1(tPA)-R304Q(c39), resulting in only fourfold changes in the PAI-1 inhibition rate. Surface plasmon resonance revealed that the affinity of initial reversible complex formation between PAI-1 and catalytically inactive Ser195-->Ala variants of thrombin and thrombin-VR1(tPA) is only increased fivefold, i.e. KD is 652 and 128 nM for thrombin-S195A and thrombin-S195A-VR1(tPA), respectively. We established that the partition ratio of the suicide substrate reaction between the proteases and PAI-1 was largely unaffected in any variant studied. Hirugen allosterically decreases the rate of thrombin inhibition by PAI-1 2.5-fold and of thrombin-VR1(tPA) 20-fold, by interfering with a unimolecular step in the reaction, not by decreasing initial complex formation or by altering the stoichiometry. Finally, kinetic modeling demonstrated that acylation is the rate-limiting step in thrombin inhibition by PAI-1 (k approximately 10(-3) s(-1)) and this kinetic block is alleviated by the introduction of the tPA-VR1 into thrombin (k>1 s(-1)). We propose that the length, flexibility and different charge architecture of the VR1 loop of t-PA invoke an induced fit of the reactive center loop of PAI-1, thereby enhancing the rate of acylation in the Michaelis complex between thrombin-VR1(t-PA) and PAI-1 by more than two orders of magnitude.

Abstract aus PubMed (NCBI) für den zitierten Eintrag, in der Originalsprache wiedergegeben. Maßgeblich ist die Fassung der Originalpublikation.

Das Abstract wird nicht übersetzt, damit die eigene Wortwahl der Autoren erhalten bleibt.

Der Austausch der VR1/37-Schleife von Thrombin gegen die VR1 von t-PA beschleunigt die PAI-1-Hemmung um drei Größenordnungen. Die Kristallstruktur von Thrombin-VR1(tPA) zeigte eine erhaltene α-Thrombin-Struktur mit teilweise ungeordneter VR1. Die Affinität der initialen reversiblen Komplexbildung stieg bei katalytisch inaktiven S195A-Varianten nur fünffach (KD 652 bzw. 128 nM). Die Acylierung ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt (k ≈ 10⁻³ s⁻¹); die t-PA-VR1 hebt diese kinetische Blockade auf (k > 1 s⁻¹), wofür die Autoren eine induzierte Anpassung der reaktiven Schleife von PAI-1 vorschlagen.

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