Высокопродуктивная секреция дипетарудина, химерного ингибитора тромбина, дрожжами Pichia pastoris
High-level secretion of dipetarudin, a chimeric thrombin inhibitor, by Pichia pastoris
Экспериментальное исследование in vitro в журнале Protein Expr Purif (2006)
Аннотация
Dipetarudin is a potent direct thrombin inhibitor that was genetically engineered as a chimera between dipetalogastin II and hirudin. Dipetarudin was initially cloned and purified from Escherichia coli, but with a very low yield of about 0.3 mg/l of culture medium. In this study, we report the production of dipetarudin in the methylotrophic yeast Pichia pastoris using pPIC9 vector. The His+ transformants were screened for the best expression performances by prolongation of the ecarin clotting time. An optimal dipetarudin's expression was reached by addition of methanol in culture medium to a final concentration of 0.5%, every 8h during 4 days. Secreted dipetarudin was purified essentially using a two-step purification scheme: anion exchange chromatography in a Resource Q column, followed by C18-reversed phase HPLC. About 150 mg purified dipetarudin was obtained from 1l culture supernatant. This yield is 500-fold higher than the yield obtained with the E. coli system. The molecular mass of dipetarudin calculated by MALDI-TOF (7450 Da) was in agreement with the mass calculated by the amino acid composition (7454 Da), indicating correct processing of the signal sequence. The Ki value of dipetarudin was 399+/-83 fM, which is in agreement with that calculated for the inhibitor isolated from E. coli. This efficient and cost-effective expression system facilitates large-scale production and purification of dipetarudin for further structural, functional and pharmacological investigations.
Аннотация взята из PubMed (NCBI) для цитируемой записи и приводится на языке оригинала. Авторитетной является версия в исходной публикации.
Аннотация оставлена без перевода, чтобы сохранить собственные формулировки авторов.
Резюме
Дипетарудин — химерный прямой ингибитор тромбина, соединяющий дипеталогастин II и гирудин; в E. coli его получали с выходом около 0,3 мг/л. Авторы наработали дипетарудин в Pichia pastoris (вектор pPIC9) при индукции 0,5% метанолом каждые 8 ч в течение 4 сут. Двухстадийная очистка (анионообменная хроматография и обращённо-фазовая ВЭЖХ) дала около 150 мг белка с 1 л среды — в 500 раз больше, чем в E. coli. Масса по MALDI-TOF (7450 Да) согласуется с расчётной (7454 Да), Ki составила 399±83 фМ.
Почему это важно для гирудотерапии
В этом исследовании сообщается о высокоуровневой секреции дипетарудина — генетически сконструированного химерного прямого ингибитора тромбина, сочетающего дипеталогастин II и гирудин — в Pichia pastoris, что позволило получить примерно 150 мг очищенного белка на литр культуральной жидкости, что в 500 раз превосходит показатель E. coli. Очищенный продукт имел массу 7450 Да по данным MALDI-TOF, что согласуется с правильным процессингом сигнальной последовательности, и Ki 399 ± 83 фМ для ингибирования тромбина, что соответствует ингибитору, полученному из E. coli. Дипетарудин включает гирудин в качестве химерного компонента, а в исследовании рассматривается экономически эффективное крупномасштабное производство. Оговорка: это исследование по оптимизации биотехнологического процесса и системы экспрессии; оно не содержит данных in vivo, на животных или клинических фармакологических данных, и его актуальность ограничивается технологией рекомбинантного производства, а не гирудотерапией.
Связанные соединения в реестре ASH
Молекулы из пиявки и препараты на основе гирудина, связанные с темой данной статьи; у каждого есть полный профиль в реестре соединений ASH:
Цитирование
Библиографическая ссылка (стиль Vancouver)
Lopez M, Koehler A, Nowak G. High-level secretion of dipetarudin, a chimeric thrombin inhibitor, by Pichia pastoris. Protein Expr Purif. 2007;52(1):8-13. doi:10.1016/j.pep.2006.10.009. PMID: 17157531
Библиографические данные (авторы, том, страницы, DOI) взяты из записи PubMed.
Связанный клинический контекст
Узнайте, как это исследование связано с клинической практикой
Похожие исследования
Другие рецензируемые исследования в разделе «Фармакология секрета слюнных желёз».
- Медицинские пиявки и гирудотерапия — Gödekmerdan A et al. (2011)
- Перекисное окисление липидов слюны у пациентов с постковидным синдромом на фоне гирудотерапии — Serikbayeva S et al. (2024)
- Лечение медицинскими пиявками при болевых синдромах: нарративный обзор — Koeppen D, Aurich M, Rampp T (2014)
- Иммуномодулирующие эффекты экстракта слюны медицинской пиявки на активированные макрофаги in vitro — Ayhan H et al. (2024)
- Ингибиторы протеиназ медицинской пиявки Hirudo medicinalis — Baskova I, Zavalova L (2001)
- Полифункциональность дестабилазы — лизоцима медицинской пиявки — Baskova I, Zavalova L (2008)
- «Удвоение»: идентификация и характеристика тандем-гирудина из азиатской медицинской пиявки Hirudinaria manillensis — Lukas P et al. (2022)
- Применение медицинской пиявки в лечении заболеваний уха — Seleznev K et al. (1992)
- Рекомбинантная дестабилаза из Hirudo medicinalis способна растворять тромбы человека in vitro — Bobrovsky P et al. (2021)
- Влияние рассеяния углеродных нанотрубок в окружающей среде на водного беспозвоночного Hirudo medicinalis — Girardello R et al. (2015)
Добавлено в библиотеку ASH: 27 мая 2026 г. · Последнее обновление сайта: 18 июня 2026 г.