High-level secretion of dipetarudin, a chimeric thrombin inhibitor, by Pichia pastoris
Research article published in Protein Expr Purif (2006)
Abstract
Dipetarudin is a potent direct thrombin inhibitor that was genetically engineered as a chimera between dipetalogastin II and hirudin. Dipetarudin was initially cloned and purified from Escherichia coli, but with a very low yield of about 0.3 mg/l of culture medium. In this study, we report the production of dipetarudin in the methylotrophic yeast Pichia pastoris using pPIC9 vector. The His+ transformants were screened for the best expression performances by prolongation of the ecarin clotting time. An optimal dipetarudin's expression was reached by addition of methanol in culture medium to a final concentration of 0.5%, every 8h during 4 days. Secreted dipetarudin was purified essentially using a two-step purification scheme: anion exchange chromatography in a Resource Q column, followed by C18-reversed phase HPLC. About 150 mg purified dipetarudin was obtained from 1l culture supernatant. This yield is 500-fold higher than the yield obtained with the E. coli system. The molecular mass of dipetarudin calculated by MALDI-TOF (7450 Da) was in agreement with the mass calculated by the amino acid composition (7454 Da), indicating correct processing of the signal sequence. The Ki value of dipetarudin was 399+/-83 fM, which is in agreement with that calculated for the inhibitor isolated from E. coli. This efficient and cost-effective expression system facilitates large-scale production and purification of dipetarudin for further structural, functional and pharmacological investigations.
Abstract sourced from PubMed (NCBI) for the cited record. See the original publication for the authoritative version.
Резюме
Dipetarudin, a chimera between dipetalogastin II and hirudin, expressed in Pichia pastoris at 150 mg/L purified yield (500-fold higher than E.
Почему это важно для гирудотерапии
В этом исследовании сообщается о высокоуровневой секреции дипетарудина — генетически сконструированного химерного прямого ингибитора тромбина, сочетающего дипеталогастин II и гирудин — в Pichia pastoris, что позволило получить примерно 150 мг очищенного белка на литр культуральной жидкости, что в 500 раз превосходит показатель E. coli. Очищенный продукт имел массу 7450 Да по данным MALDI-TOF, что согласуется с правильным процессингом сигнальной последовательности, и Ki 399 ± 83 фМ для ингибирования тромбина, что соответствует ингибитору, полученному из E. coli. Для ASH это имеет значение, поскольку дипетарудин включает гирудин в качестве химерного компонента, а в исследовании рассматривается экономически эффективное крупномасштабное производство. Оговорка: это исследование по оптимизации биотехнологического процесса и системы экспрессии; оно не содержит данных in vivo, на животных или клинических фармакологических данных, и его актуальность ограничивается технологией рекомбинантного производства, а не гирудотерапией.
Цитирование
High-level secretion of dipetarudin, a chimeric thrombin inhibitor, by Pichia pastoris.
Lopez M et al. · Protein Expr Purif, 2006
Связанный клинический контекст
Узнайте, как это исследование связано с клинической практикой
Добавлено в библиотеку ASH: May 27, 2026 · Последнее обновление сайта: 18 июня 2026 г.