Secreción elevada de dipetarudina, un inhibidor quimérico de la trombina, por Pichia pastoris

Dipetarudin is a potent direct thrombin inhibitor that was genetically engineered as a chimera between dipetalogastin II and hirudin. Dipetarudin was initially cloned and purified from Escherichia coli, but with a very low yield of about 0.3 mg/l of culture medium. In this study, we report the production of dipetarudin in the methylotrophic yeast Pichia pastoris using pPIC9 vector. The His+ transformants were screened for the best expression performances by prolongation of the ecarin clotting time. An optimal dipetarudin's expression was reached by addition of methanol in culture medium to a final concentration of 0.5%, every 8h during 4 days. Secreted dipetarudin was purified essentially using a two-step purification scheme: anion exchange chromatography in a Resource Q column, followed by C18-reversed phase HPLC. About 150 mg purified dipetarudin was obtained from 1l culture supernatant. This yield is 500-fold higher than the yield obtained with the E. coli system. The molecular mass of dipetarudin calculated by MALDI-TOF (7450 Da) was in agreement with the mass calculated by the amino acid composition (7454 Da), indicating correct processing of the signal sequence. The Ki value of dipetarudin was 399+/-83 fM, which is in agreement with that calculated for the inhibitor isolated from E. coli. This efficient and cost-effective expression system facilitates large-scale production and purification of dipetarudin for further structural, functional and pharmacological investigations.

Resumen tomado de PubMed (NCBI) para el registro citado, en el idioma original. La versión de referencia es la de la publicación original.

El resumen se deja sin traducir para conservar la redacción original de los autores.

Se describe la producción del inhibidor quimérico de la trombina dipetarudina en Pichia pastoris; expresión óptima con metanol al 0,5 % cada 8 h. Tras intercambio aniónico y HPLC en fase reversa C18 se obtuvieron unos 150 mg por litro, 500 veces más que en E. coli. La masa por MALDI-TOF (7450 Da) coincidió con la calculada (7454 Da); el Ki fue 399 ± 83 fM. Según los autores, el sistema facilita la producción a gran escala.

Explore cómo esta investigación se conecta con la práctica clínica

Más estudios revisados por pares en la categoría «Farmacología salival».

• Sanguijuelas medicinales e hirudoterapia — Gödekmerdan A et al. (2011)
• Peroxidación de lípidos salivales en pacientes con síndrome poscovid durante la hirudoterapia — Serikbayeva S et al. (2024)
• Terapia con sanguijuelas medicinales en síndromes dolorosos: una revisión narrativa — Koeppen D, Aurich M, Rampp T (2014)
• Efectos inmunomoduladores del extracto de saliva de la sanguijuela medicinal sobre macrófagos activados in vitro — Ayhan H et al. (2024)
• Inhibidores de proteinasas de la sanguijuela medicinal Hirudo medicinalis — Baskova I, Zavalova L (2001)
• Polifuncionalidad de la destabilasa, una lisozima de una sanguijuela medicinal — Baskova I, Zavalova L (2008)
• Hazlo doble: identificación y caracterización de una hirudina en tándem de la sanguijuela medicinal asiática Hirudinaria manillensis — Lukas P et al. (2022)
• Use of the medicinal leech in the treatment of ear diseases — Seleznev K et al. (1992)
• La destabilasa recombinante de Hirudo medicinalis puede disolver coágulos sanguíneos humanos in vitro — Bobrovsky P et al. (2021)
• Efectos de la dispersión ambiental de nanotubos de carbono sobre un invertebrado acuático, Hirudo medicinalis — Girardello R et al. (2015)

Ver toda la investigación analizada por la ASH →