Expresión, purificación y caracterización de cantidades multigramo de una variante recombinante híbrida HV1-HV2 de hirudina expresada en Saccharomyces cerevisiae

Hirudin (HIR), derived from leeches, and tick anticoagulant peptide (TAP) are polypeptide protease inhibitors of thrombin and coagulation factor Xa (fXa), respectively, and they have both shown utility in vitro and in vivo as potent antithrombotic agents. A thorough side-by-side comparison of the in vivo efficacy of factor Xa inhibition compared to thrombin inhibition by TAP and HIR, respectively, required purification and characterization of multigram amounts of hirudin. Therefore, a recombinant Saccharomyces cerevisiae strain was developed using a plasmid containing the gene encoding the MF alpha 1 preproleader, a synthetic hybrid HV1-HV2 HIR gene, and a galactose-inducible promoter which directed the secretion of 44 mg/liter of recombinant HIR (rHIR) after induction. rHIR was purified by a process that consisted of two chromatographic steps and decolorization. Total yield for the purification process was 3.6 g, or 41%. This process gave 59-fold purification of rHIR that was judged to be > 96% pure with regard to polypeptide content by capillary zonal electrophoresis and reversed-phase high-performance liquid chromatography. Single, unique N- and C-termini were obtained by sequencing and were identical to those predicted from the deduced sequence of the cDNA. Determination of the dissociation constant, by thrombin:hirudin inhibition reaction, and anticoagulant activity, by the activated partial thromboplastin time, demonstrated that the hybrid rHIR HV1-HV2 protein discussed in this report was essentially equipotent with rHIR preparations HV1 and HV2 reported by others.

Resumen tomado de PubMed (NCBI) para el registro citado, en el idioma original. La versión de referencia es la de la publicación original.

El resumen se deja sin traducir para conservar la redacción original de los autores.

Una cepa recombinante de Saccharomyces cerevisiae con un gen híbrido HV1-HV2 de hirudina bajo promotor inducible por galactosa secretó 44 mg/l de hirudina recombinante. Tras dos pasos cromatográficos y decoloración, el rendimiento fue de 3,6 g (41 %), con purificación de 59 veces y pureza superior al 96 % por electroforesis capilar de zona y HPLC de fase inversa. Según la constante de disociación y la TTPa, la variante híbrida resultó esencialmente equipotente a las preparaciones HV1 y HV2.

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