The dual role of thrombin's anion-binding exosite-I in the recognition and cleavage of the protease-activated receptor 1
Research article published in European journal of biochemistry (2001)
Abstract
The role of thrombin anion-binding exosite-I in the recognition and cleavage of the extracellular domain of the seven transmembrane domain thrombin receptor (PAR1) was determined using site-directed mutagenesis. Basic residues in anion-binding exosite-I (Arg35, Arg36, Arg67, Arg73, Arg75, Arg77A, Lys81, Lys109, Lys110 and Lys149E) were substituted with glutamines and the resultant recombinant mutant thrombins were used to determine kinetic parameters for the cleavage of a peptide (PAR38-60) based on the PAR1 extracellular domain. Compared with wild-type thrombin, replacement of Arg67 and Arg73 had a dramatic effect on the cleavage of PAR38-60 (k(cat)/K(m) = 1.8 x 10(6) and 4.6 x 10(6) vs 9.2 x 10(7) M(-1).s(-1)), whereas the remaining mutations of the anion-binding exosite-I of thrombin had a less pronounced effect, with k(cat)/K(m) values ranging from 3.3 x 10(7) M(-1). s(-1) (R77(a)Q) to 5.8 x 10(7) M(-1).s(-1) (K109Q). The ability of thrombin mutants to activate platelets paralleled that of PAR38-60 cleavage, whereas their ability to clot fibrinogen differed profoundly, as did their susceptibility to hirudin inhibition. Results are interpreted with respect to known interactions of thrombin with thrombomodulin, hirudin, rhodniin and heparin cofactor II. We conclude that the basic residues of anion-binding exosite-I contribute significantly to enhancing the rate of complex formation in two ways; the first (general) ensures electrostatic steering of ligands with complementary electrostatic fields, the second (specific) involves a combination of molecular contacts within the complex that is unique for each ligand.
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Zusammenfassung
The role of thrombin anion-binding exosite-I in the recognition and cleavage of the extracellular domain of the seven transmembrane domain thrombin receptor (PAR1) was determined using site-directed mutagenesis.
Warum dies für die Hirudotherapie relevant ist
Diese Studie verwendete ortsspezifische Mutagenese der basischen Reste der Anionen-bindenden Exosite-I (ABE-I) von Thrombin, um deren Rollen bei der Erkennung und Spaltung des Protease-aktivierten Rezeptors 1 (PAR1) zu analysieren. Mutationen von Arg67 und Arg73 reduzierten die PAR1-Peptidspaltungseffizienz am stärksten (kcat/Km fiel von 9,2×10^7 auf 1,8×10^6 bzw. 4,6×10^6 M−1s−1), während die Auswirkungen auf die Fibrinogengerinnung und die Empfindlichkeit gegenüber Hirudin-Inhibition bei den Mutanten sehr unterschiedlich ausfielen. Die Autoren interpretieren diese Befunde im Kontext bekannter Thrombin-Wechselwirkungen mit Hirudin, Thrombomodulin, Rhodniin und Heparin-Cofaktor II und schlussfolgern, dass ABE-I-Reste sowohl über allgemeine elektrostatische Steuerung als auch über ligandenspezifische Kontakte beitragen. Dies ist für den ASH-Bereich relevant, da es das mechanistische Verständnis vertieft, wie Hirudin an die Exosite I von Thrombin bindet. Die Studie konzentriert sich jedoch auf die Thrombin-Molekularbiologie unter Verwendung von Mutagenese; Hirudin wird als Vergleichsligand diskutiert und ist nicht der primäre Untersuchungsgegenstand.
Zitation
The dual role of thrombin's anion-binding exosite-I in the recognition and cleavage of the protease-activated receptor 1
Myles T et al. · European journal of biochemistry, 2001
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Zur ASH-Bibliothek hinzugefügt: May 27, 2026 · Letzte Aktualisierung der Website: 18. Juni 2026