High-level secretion of dipetarudin, a chimeric thrombin inhibitor, by Pichia pastoris
Research article published in Protein Expr Purif (2006)
Abstract
Dipetarudin is a potent direct thrombin inhibitor that was genetically engineered as a chimera between dipetalogastin II and hirudin. Dipetarudin was initially cloned and purified from Escherichia coli, but with a very low yield of about 0.3 mg/l of culture medium. In this study, we report the production of dipetarudin in the methylotrophic yeast Pichia pastoris using pPIC9 vector. The His+ transformants were screened for the best expression performances by prolongation of the ecarin clotting time. An optimal dipetarudin's expression was reached by addition of methanol in culture medium to a final concentration of 0.5%, every 8h during 4 days. Secreted dipetarudin was purified essentially using a two-step purification scheme: anion exchange chromatography in a Resource Q column, followed by C18-reversed phase HPLC. About 150 mg purified dipetarudin was obtained from 1l culture supernatant. This yield is 500-fold higher than the yield obtained with the E. coli system. The molecular mass of dipetarudin calculated by MALDI-TOF (7450 Da) was in agreement with the mass calculated by the amino acid composition (7454 Da), indicating correct processing of the signal sequence. The Ki value of dipetarudin was 399+/-83 fM, which is in agreement with that calculated for the inhibitor isolated from E. coli. This efficient and cost-effective expression system facilitates large-scale production and purification of dipetarudin for further structural, functional and pharmacological investigations.
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Zusammenfassung
Dipetarudin, a chimera between dipetalogastin II and hirudin, expressed in Pichia pastoris at 150 mg/L purified yield (500-fold higher than E.
Warum dies für die Hirudotherapie relevant ist
Diese Studie berichtet über die hochgradige Sekretion von Dipetarudin – eines gentechnisch hergestellten chimären direkten Thrombininhibitors, der Dipetalogastin II und Hirudin kombiniert – in Pichia pastoris, wobei etwa 150 mg gereinigtes Protein pro Liter Kulturüberstand erreicht wurden, was einer 500-fachen Verbesserung gegenüber E. coli entspricht. Das gereinigte Produkt wies eine mittels MALDI-TOF bestimmte Masse von 7450 Da auf, die mit einer korrekten Prozessierung der Signalsequenz vereinbar ist, sowie einen Ki-Wert von 399 ± 83 fM für die Thrombininhibition, der dem aus E. coli gewonnenen Inhibitor entspricht. Für ASH ist dies relevant, da Dipetarudin Hirudin als chimäre Komponente enthält und die Studie sich mit einer kosteneffizienten Produktion im großen Maßstab befasst. Einschränkung: Es handelt sich um eine Studie zur Bioprozess- bzw. Expressionssystem-Optimierung; sie enthält keine tierexperimentellen, klinischen oder In-vivo-pharmakologischen Daten, und die Relevanz liegt in der rekombinanten Produktionstechnologie und nicht in der Hirudotherapie.
Zitation
High-level secretion of dipetarudin, a chimeric thrombin inhibitor, by Pichia pastoris.
Lopez M et al. · Protein Expr Purif, 2006
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Zur ASH-Bibliothek hinzugefügt: May 27, 2026 · Letzte Aktualisierung der Website: 18. Juni 2026