Analyse rekombinanter Proteine durch isoelektrische Fokussierung in immobilisierten pH-Gradienten

Isoelectric focusing in immobilized pH gradients (IEF-IPG) was used to analyze three different recombinant proteins. Recombinant leech hirudin (65 amino acids, three disulfide bonds) expressed in Saccharomyces cerevisiae as a secreted protein and purified by anion-exchange and reversed-phase chromatography proved to be homogeneous with regard to its isoelectric point (pI). In addition, the theoretical pI, calculated on the basis of the primary structure, corresponded precisely to the measured pI of 4.30. IEF-IPG was further employed to follow the stability of recombinant hirudin at pH 9, indicating that deamidation occurred under these conditions. A variant of recombinant human alpha 1-antitrypsin (AAT) (389 amino acids, one cysteine residue) expressed in Escherichia coli and purified by anion-exchange, metal chelate and hydrophobic-interaction chromatography appeared to be homogeneous by polyacrylamide gel electrophoresis under reducing and denaturing conditions as well as by various high performance liquid chromatography methods. However, some heterogeneity was detected by IEF-IPG between pH 5-6. The measured pI values of 5.43-5.58 were slightly lower than the calculated pI based on the primary structure (5.72). This indicated deamidations of Asn or Gln residues. A recombinant Schistosoma mansoni parasite antigen, p28 (210 amino acids, one cysteine residue) obtained after intracellular expression in Saccharomyces cerevisiae and affinity purification on glutathione agarose was analyzed by IEF-IPG in a pH 7.3-8.3 gradient. It appeared to be heterogeneous with regard to its pI, with the major component having a pI of 7.81 compared to the calculated value of 7.17.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)

Abstract aus PubMed (NCBI) für den zitierten Eintrag, in der Originalsprache wiedergegeben. Maßgeblich ist die Fassung der Originalpublikation.

Das Abstract wird nicht übersetzt, damit die eigene Wortwahl der Autoren erhalten bleibt.

Drei rekombinante Proteine wurden mittels isoelektrischer Fokussierung in immobilisierten pH-Gradienten (IEF-IPG) charakterisiert. Das in Saccharomyces cerevisiae exprimierte, sezernierte Blutegel-Hirudin (65 Aminosäuren, drei Disulfidbrücken) war im isoelektrischen Punkt homogen; der berechnete Wert entsprach exakt dem gemessenen pI von 4,30, und bei pH 9 deutete IEF-IPG auf Deamidierung hin. Bei einer Variante des humanen alpha-1-Antitrypsins aus E. coli (389 Aminosäuren) zeigte IEF-IPG Heterogenität zwischen pH 5 und 6 (pI 5,43–5,58, berechnet 5,72), beim Schistosoma-mansoni-Antigen p28 ebenfalls (Hauptkomponente pI 7,81, berechnet 7,17).

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