Analysis of recombinant proteins by isoelectric focusing in immobilized pH gradients
Research article published in Electrophoresis (1992)
Abstract
Isoelectric focusing in immobilized pH gradients (IEF-IPG) was used to analyze three different recombinant proteins. Recombinant leech hirudin (65 amino acids, three disulfide bonds) expressed in Saccharomyces cerevisiae as a secreted protein and purified by anion-exchange and reversed-phase chromatography proved to be homogeneous with regard to its isoelectric point (pI). In addition, the theoretical pI, calculated on the basis of the primary structure, corresponded precisely to the measured pI of 4.30. IEF-IPG was further employed to follow the stability of recombinant hirudin at pH 9, indicating that deamidation occurred under these conditions. A variant of recombinant human alpha 1-antitrypsin (AAT) (389 amino acids, one cysteine residue) expressed in Escherichia coli and purified by anion-exchange, metal chelate and hydrophobic-interaction chromatography appeared to be homogeneous by polyacrylamide gel electrophoresis under reducing and denaturing conditions as well as by various high performance liquid chromatography methods. However, some heterogeneity was detected by IEF-IPG between pH 5-6. The measured pI values of 5.43-5.58 were slightly lower than the calculated pI based on the primary structure (5.72). This indicated deamidations of Asn or Gln residues. A recombinant Schistosoma mansoni parasite antigen, p28 (210 amino acids, one cysteine residue) obtained after intracellular expression in Saccharomyces cerevisiae and affinity purification on glutathione agarose was analyzed by IEF-IPG in a pH 7.3-8.3 gradient. It appeared to be heterogeneous with regard to its pI, with the major component having a pI of 7.81 compared to the calculated value of 7.17.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)
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Zusammenfassung
IEF-IPG analysis of recombinant leech hirudin expressed in S. cerevisiae; homogeneous pI of 4.30 matching primary structure; deamidation detected under alkaline conditions.
Warum dies für die Hirudotherapie relevant ist
Diese Studie verwendete isoelektrische Fokussierung in immobilisierten pH-Gradienten (IEF-IPG) zur Analyse von drei rekombinanten Proteinen, darunter rekombinantes Blutegel-Hirudin, exprimiert in Saccharomyces cerevisiae, und bewertete Ladungshomogenität und Stabilität. Rekombinantes Blutegel-Hirudin (65 Aminosäuren, drei Disulfidbrücken) erwies sich als homogen mit einem gemessenen pI von 4,30, der mit dem theoretischen Wert übereinstimmte, während die IEF-IPG auch Desamidierung bei pH 9 verfolgte. Für ASH liefert diese Arbeit eine analytische Charakterisierung eines aus Blutegeln stammenden Proteins, obwohl der Abstract weder dessen biologische Funktion noch einen pharmazeutischen Kontext beschreibt. Einschränkung: Es handelt sich um eine Arbeit zu analytischen Methoden mit Fokus auf Proteinladungscharakterisierung; sie enthält keine therapeutischen, pharmakologischen, in-vivo- oder klinischen Daten zur Aktivität von Hirudin.
Zitation
Analysis of recombinant proteins by isoelectric focusing in immobilized pH gradients.
Bischoff R et al. · Electrophoresis, 1992
Verwandter klinischer Kontext
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Zur ASH-Bibliothek hinzugefügt: May 27, 2026 · Letzte Aktualisierung der Website: 18. Juni 2026