Optimización de las interacciones proteasa-inhibidor mediante la aleatorización de contactos adventicios

Polypeptide protease inhibitors are often found to inhibit targets with which they did not coevolve, as in the case of high-affinity inhibition of bacterial subtilisin by the leech inhibitor eglin c. Two kinds of contacts exist in such complexes: (i) reactive site loop-active site contacts and (ii) interactions outside of these that form the broader enzyme-inhibitor interface. We hypothesized that the second class of "adventitious" contacts could be optimized to generate significant increases in affinity for a target enzyme or discrimination of an inhibitor for closely related target proteases. We began with a modified eglin c, Arg-42-Arg-45-eglin, in which the reactive site loop had been optimized for subtilisin-related processing proteases of the Kex2/furin family. We randomized 10 potential adventitious contact residues and screened for inhibition of soluble human furin. Substitutions at one of these sites, Y49, were also screened against yeast Kex2 and human PC7. These screens identified not only variants that exhibited increased affinity (up to 20-fold), but also species that exhibited enhanced selectivity, that is, increased discrimination between the target enzymes (up to 41-fold for furin versus PC7 and 20-fold for PC7 versus furin). One variant, Asp-49-Arg-42-Arg-45-eglin, exhibited a Ki of 310 pM for furin and blocked furin-dependent processing of von Willebrand factor in COS-1 cells when added to the culture medium of the cells. The exploitation of adventitious contact sites may provide a versatile technique for developing potent, selective inhibitors for newly discovered proteases and could in principle be applied to optimize numerous protein-protein interactions.

Resumen tomado de PubMed (NCBI) para el registro citado, en el idioma original. La versión de referencia es la de la publicación original.

El resumen se deja sin traducir para conservar la redacción original de los autores.

Partiendo del inhibidor de sanguijuela eglina C, se aleatorizaron diez contactos «adventicios» y se tamizaron contra furina humana; las sustituciones en Y49, también contra Kex2 y PC7. Surgieron variantes con afinidad hasta 20 veces mayor y selectividad de hasta 41 veces (furina frente a PC7). Una variante inhibió furina con Ki de 310 pM y bloqueó el procesamiento del factor de von Willebrand en células COS-1. Según los autores, la estrategia podría generar inhibidores potentes y selectivos para proteasas nuevas.

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