El doble papel del exositio I de unión a aniones de la trombina en el reconocimiento y la escisión del receptor activado por proteasas 1

The role of thrombin anion-binding exosite-I in the recognition and cleavage of the extracellular domain of the seven transmembrane domain thrombin receptor (PAR1) was determined using site-directed mutagenesis. Basic residues in anion-binding exosite-I (Arg35, Arg36, Arg67, Arg73, Arg75, Arg77A, Lys81, Lys109, Lys110 and Lys149E) were substituted with glutamines and the resultant recombinant mutant thrombins were used to determine kinetic parameters for the cleavage of a peptide (PAR38-60) based on the PAR1 extracellular domain. Compared with wild-type thrombin, replacement of Arg67 and Arg73 had a dramatic effect on the cleavage of PAR38-60 (k(cat)/K(m) = 1.8 x 10(6) and 4.6 x 10(6) vs 9.2 x 10(7) M(-1).s(-1)), whereas the remaining mutations of the anion-binding exosite-I of thrombin had a less pronounced effect, with k(cat)/K(m) values ranging from 3.3 x 10(7) M(-1). s(-1) (R77(a)Q) to 5.8 x 10(7) M(-1).s(-1) (K109Q). The ability of thrombin mutants to activate platelets paralleled that of PAR38-60 cleavage, whereas their ability to clot fibrinogen differed profoundly, as did their susceptibility to hirudin inhibition. Results are interpreted with respect to known interactions of thrombin with thrombomodulin, hirudin, rhodniin and heparin cofactor II. We conclude that the basic residues of anion-binding exosite-I contribute significantly to enhancing the rate of complex formation in two ways; the first (general) ensures electrostatic steering of ligands with complementary electrostatic fields, the second (specific) involves a combination of molecular contacts within the complex that is unique for each ligand.

Resumen tomado de PubMed (NCBI) para el registro citado, en el idioma original. La versión de referencia es la de la publicación original.

El resumen se deja sin traducir para conservar la redacción original de los autores.

Mediante mutagénesis dirigida, se estudió el exositio I de trombina en la escisión del péptido PAR38-60. Las mutaciones Arg67 y Arg73 redujeron drásticamente la kcat/Km a 1,8 × 10^6 y 4,6 × 10^6 M^-1·s^-1 (silvestre: 9,2 × 10^7); las restantes dieron 3,3-5,8 × 10^7 M^-1·s^-1. La activación plaquetaria reflejó la escisión; la coagulación de fibrinógeno y la inhibición por hirudina difirieron. Los autores concluyen que los residuos básicos aceleran la formación del complejo por guiado electrostático y contactos específicos.

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