Estudios de estructura-función y de replegamiento del inhibidor específico de la trombina hirudina

We have developed a novel expression and purification system that yields recombinant desulfo-hirudin (HV-1) with high specific activity (10,000 antithrombin units/mg) and an inhibition constant (Ki) for human alpha-thrombin of 0.2 pM. Reduced and denatured hirudin rapidly refolds to the native, fully active conformation at high concentration (greater than 50 mg/ml) by incubation at pH 10. Analytical gel filtration studies at neutral pH suggest that hirudin is a multimer. Initial binding of hirudin to thrombin appears to be followed by dissociation of the hirudin multimer to give a tight-binding 1:1 hirudin:thrombin complex. Thrombin inhibition studies showed that hirudin synthetic peptide fragments 42-65 and 51-65 [but not (Ala22)-6-28, containing two of the three disulfide bonds formed in native hirudin] were similarly effective in inhibiting thrombin cleavage of fibrinogen (IC50 = 4.9 and 6.0 microM, respectively, at a thrombin concentration of 1 microM). We conclude that hirudin has unusual structural and refolding properties and that its mechanism of inhibition involves noncovalent interaction with multiple sites on thrombin. The interaction of hirudin (specifically the region of Lys-47) with the basic specificity pocket of thrombin may contribute to the binding but is not essential for its inhibitory activity.

Resumen tomado de PubMed (NCBI) para el registro citado, en el idioma original. La versión de referencia es la de la publicación original.

El resumen se deja sin traducir para conservar la redacción original de los autores.

Se describe un sistema para desulfo-hirudina recombinante (HV-1) con 10 000 ATU/mg y Ki = 0,2 pM. La hirudina reducida se renaturaliza a > 50 mg/ml y pH 10; la filtración en gel sugiere un multímero. Los fragmentos 42-65 y 51-65 inhibieron la escisión de fibrinógeno (IC50 = 4,9 y 6,0 µM); (Ala22)-6-28 fue inactivo. Los autores concluyen interacciones no covalentes con múltiples sitios de trombina; la región de Lys-47 podría contribuir a la unión pero no es esencial.

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