Mejoras técnicas en la manipulación genética de Pichia pastoris y su aplicación en la expresión de hirudina

Pichia pastoris has become an increasingly popular host for heterologous protein production. However, there is neither a high-efficient transformation method nor a fast colony-PCR assay for the yeast yet. In this paper, we report a transformation procedure by electroporation, which reaches the value of up to 2800 transformants/microgram DNA. By using a cold and heat treatment and a modified PCR buffer, we established a simple and reliable colony-PCR protocol to detect recombinant P. pastoris clones, which is comparable to the conventional assay for E. coli colonies. With these two novel techniques, we have successfully achieved the expression of hirudin, an antithrombin agent, in Pichia pastoris. The secreted hirudin maintains a biological activity of 82 antithrombian units per milliliter supernatant from the media.

Resumen tomado de PubMed (NCBI) para el registro citado, en el idioma original. La versión de referencia es la de la publicación original.

El resumen se deja sin traducir para conservar la redacción original de los autores.

Pichia pastoris, hospedador popular para proteínas heterólogas, carecía de transformación eficiente y de una PCR de colonias rápida. Los autores describen una transformación por electroporación con hasta 2800 transformantes por microgramo de ADN y un protocolo de PCR de colonias sencillo y fiable, con tratamiento de frío y calor y tampón modificado, comparable al de Escherichia coli. Con ambas técnicas expresaron hirudina, agente antitrombínico; la hirudina secretada mantiene una actividad de 82 unidades antitrombina por mililitro de sobrenadante.

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