Kinetik der Hemmung von Thrombin durch Hirudin

The dissociation constant for hirudin was determined by varying the concentration of hirudin in the presence of a fixed concentration of thrombin and tripeptidyl p-nitroanilide substrate. The estimate of the dissociation constant determined in this manner displayed a dependence on the concentration of substrate which suggested the existence of two binding sites at which the substrate was able to compete with hirudin. A high-affinity site could be correlated with the binding of the substrate at the active site, and the other site had an affinity for the substrate that was 2 orders of magnitude lower. Extrapolation to zero substrate concentration yielded a value of 20 fM for the dissociation constant of hirudin at an ionic strength of 0.125. The dissociation constant for hirudin was markedly dependent on the ionic strength of the assay; it increased 20-fold when the ionic strength was increased from 0.1 to 0.4. This increase in dissociation constant was accompanied by a decrease in the rate with which hirudin associated with thrombin. This rate could be measured with a conventional recording spectrophotometer at higher ionic strength and was found to be independent of the binding of substrate at the active site.

Abstract aus PubMed (NCBI) für den zitierten Eintrag, in der Originalsprache wiedergegeben. Maßgeblich ist die Fassung der Originalpublikation.

Das Abstract wird nicht übersetzt, damit die eigene Wortwahl der Autoren erhalten bleibt.

In dieser In-vitro-Studie wurde die Dissoziationskonstante von Hirudin bei fixierter Thrombin- und Substratkonzentration bestimmt. Die Abhängigkeit von der Substratkonzentration deutete auf zwei Bindungsstellen hin, an denen das Substrat mit Hirudin konkurriert; die hochaffine entsprach dem aktiven Zentrum, die andere band 2 Größenordnungen schwächer. Extrapolation auf Substratkonzentration null ergab bei Ionenstärke 0,125 eine Dissoziationskonstante von 20 fM. Sie stieg 20-fach, wenn die Ionenstärke von 0,1 auf 0,4 erhöht wurde, begleitet von einer langsameren Assoziation.

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