Struktur-Funktions- und Rückfaltungsstudien des thrombinspezifischen Inhibitors Hirudin

We have developed a novel expression and purification system that yields recombinant desulfo-hirudin (HV-1) with high specific activity (10,000 antithrombin units/mg) and an inhibition constant (Ki) for human alpha-thrombin of 0.2 pM. Reduced and denatured hirudin rapidly refolds to the native, fully active conformation at high concentration (greater than 50 mg/ml) by incubation at pH 10. Analytical gel filtration studies at neutral pH suggest that hirudin is a multimer. Initial binding of hirudin to thrombin appears to be followed by dissociation of the hirudin multimer to give a tight-binding 1:1 hirudin:thrombin complex. Thrombin inhibition studies showed that hirudin synthetic peptide fragments 42-65 and 51-65 [but not (Ala22)-6-28, containing two of the three disulfide bonds formed in native hirudin] were similarly effective in inhibiting thrombin cleavage of fibrinogen (IC50 = 4.9 and 6.0 microM, respectively, at a thrombin concentration of 1 microM). We conclude that hirudin has unusual structural and refolding properties and that its mechanism of inhibition involves noncovalent interaction with multiple sites on thrombin. The interaction of hirudin (specifically the region of Lys-47) with the basic specificity pocket of thrombin may contribute to the binding but is not essential for its inhibitory activity.

Abstract aus PubMed (NCBI) für den zitierten Eintrag, in der Originalsprache wiedergegeben. Maßgeblich ist die Fassung der Originalpublikation.

Das Abstract wird nicht übersetzt, damit die eigene Wortwahl der Autoren erhalten bleibt.

Die Arbeit etabliert ein System für rekombinantes Desulfo-Hirudin (HV-1): 10 000 ATU/mg, Ki = 0,2 pM gegen α-Thrombin. Reduziertes Hirudin faltet sich bei > 50 mg/ml und pH 10 in die native Form zurück; Gelfiltration deutet auf ein Multimer. Die Fragmente 42-65 und 51-65 hemmten die Fibrinogenspaltung (IC50 = 4,9 bzw. 6,0 µM); (Ala22)-6-28 mit zwei Disulfiden war unwirksam. Die Wechselwirkung der Lys-47-Region könnte zur Bindung beitragen, ist aber nicht essenziell; die Autoren folgern nichtkovalente Wechselwirkungen mit mehreren Thrombinstellen.

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