Kombinatorische Evolution von Enzymen und synthetischen Wegen mittels Einstufen-PCR

DNA engineering is the fundamental motive driving the rapid development of modern biotechnology. Here, we present a versatile evolution method termed "rapidly efficient combinatorial oligonucleotides for directed evolution" (RECODE) for rapidly introducing multiple combinatorial mutations to the target DNA by combined action of a thermostable high-fidelity DNA polymerase and a thermostable DNA Ligase in one reaction system. By applying this method, we rapidly constructed a variant library of the rpoS promoters (with activity of 8-460%), generated a novel heparinase from the highly specific leech hyaluronidase (with more than 30 mutant residues) and optimized the heme biosynthetic pathway by combinatorial evolution of regulatory elements and pathway enzymes (2500 ± 120 mg L(-1) with 20-fold increase). The simple RECODE method enabled researchers the unparalleled ability to efficiently create diverse mutant libraries for rapid evolution and optimization of enzymes and synthetic pathways.

Abstract aus PubMed (NCBI) für den zitierten Eintrag, in der Originalsprache wiedergegeben. Maßgeblich ist die Fassung der Originalpublikation.

Das Abstract wird nicht übersetzt, damit die eigene Wortwahl der Autoren erhalten bleibt.

Vorgestellt wird die Methode RECODE («rapidly efficient combinatorial oligonucleotides for directed evolution»), mit der in einem Reaktionssystem multiple kombinatorische Mutationen in Ziel-DNA eingebracht werden, indem eine thermostabile DNA-Polymerase mit hoher Kopiertreue und eine thermostabile DNA-Ligase zusammenwirken. Damit erzeugten die Autoren eine Bibliothek von rpoS-Promotorvarianten (Aktivität 8–460 %), eine neue Heparinase aus der hochspezifischen Blutegel-Hyaluronidase (über 30 mutierte Reste) und optimierten die Häm-Biosynthese (2500 ± 120 mg/L, 20-fache Steigerung). RECODE ermögliche vielfältige Mutantenbibliotheken für schnelle Evolution und Optimierung, so die Autoren.

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