Ein effizienter und robuster Labor-Workflow und eine Tetrapoden-Datenbank für Umwelt-DNA-Studien in größerem Maßstab

BACKGROUND: The use of environmental DNA for species detection via metabarcoding is growing rapidly. We present a co-designed lab workflow and bioinformatic pipeline to mitigate the 2 most important risks of environmental DNA use: sample contamination and taxonomic misassignment. These risks arise from the need for polymerase chain reaction (PCR) amplification to detect the trace amounts of DNA combined with the necessity of using short target regions due to DNA degradation. FINDINGS: Our high-throughput workflow minimizes these risks via a 4-step strategy: (i) technical replication with 2 PCR replicates and 2 extraction replicates; (ii) using multi-markers (12S,16S,CytB); (iii) a "twin-tagging," 2-step PCR protocol; and (iv) use of the probabilistic taxonomic assignment method PROTAX, which can account for incomplete reference databases. Because annotation errors in the reference sequences can result in taxonomic misassignment, we supply a protocol for curating sequence datasets. For some taxonomic groups and some markers, curation resulted in >50% of sequences being deleted from public reference databases, owing to (i) limited overlap between our target amplicon and reference sequences, (ii) mislabelling of reference sequences, and (iii) redundancy. Finally, we provide a bioinformatic pipeline to process amplicons and conduct PROTAX assignment and tested it on an invertebrate-derived DNA dataset from 1,532 leeches from Sabah, Malaysia. Twin-tagging allowed us to detect and exclude sequences with non-matching tags. The smallest DNA fragment (16S) amplified most frequently for all samples but was less powerful for discriminating at species rank. Using a stringent and lax acceptance criterion we found 162 (stringent) and 190 (lax) vertebrate detections of 95 (stringent) and 109 (lax) leech samples. CONCLUSIONS: Our metabarcoding workflow should help research groups increase the robustness of their results and therefore facilitate wider use of environmental and invertebrate-derived DNA, which is turning into a valuable source of ecological and conservation information on tetrapods.

Abstract aus PubMed (NCBI) für den zitierten Eintrag, in der Originalsprache wiedergegeben. Maßgeblich ist die Fassung der Originalpublikation.

Das Abstract wird nicht übersetzt, damit die eigene Wortwahl der Autoren erhalten bleibt.

Entwickelt wurden Labor-Workflow und bioinformatische Pipeline gegen die zwei Hauptrisiken von Umwelt-DNA, Probenkontamination und taxonomische Fehlzuordnung: technische Replikate, Multi-Marker (12S, 16S, CytB), Twin-Tagging-PCR und probabilistische Zuordnung per PROTAX. Die Kuratierung öffentlicher Referenzdatenbanken entfernte für manche Gruppen und Marker >50 % der Sequenzen. Getestet wurde der Ansatz an DNA von 1 532 Blutegeln aus Sabah (Malaysia): 162 (streng) und 190 (lax) Wirbeltier-Nachweise in 95 bzw. 109 Blutegelproben. Der Workflow soll die Robustheit erhöhen und die breitere Anwendung fördern.

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