Hydrolyse und Resynthese einer einzelnen Peptidbindung der reaktiven Stelle in rekombinantem Antistasin durch den Gerinnungsfaktor Xa

Antistasin (ATS) is a 119-amino acid, leech-derived protein which exhibits selective, tight-binding inhibition of blood coagulation factor Xa. Prolonged incubation of ATS with factor Xa leads to the highly specific hydrolysis of the peptide bond between residues Arg34 and Val35, implicating this peptide bond as the putative reactive site. We report here the preparation of pure, cleaved (modified) recombinant ATS (rATS) and utilize this material to provide additional proof that the cleaved peptide bond is in fact the reactive site. Modified rATS retains strong inhibitory potency against factor Xa as evidenced by a dissociation constant of 166.3 +/- 9.6 pM; four-fold greater than that of native inhibitor, 43.4 +/- 1.4 pM. Incubation of pure, modified rATS with catalytic amounts of factor Xa results in resynthesis of the hydrolyzed peptide bond, achieving an equilibrium near unity between native and modified inhibitors. Specific removal of the newly formed carboxy-terminal Arg residue from modified rATS by carboxypeptidase B treatment obviates its conversion to native inhibitor coincident with the complete loss of inhibitory activity. These results establish that rATS inhibits factor Xa according to a standard mechanism of serine protease inhibitors and support the contention that the Arg34-Val35 peptide bond constitutes the reactive site.

Abstract aus PubMed (NCBI) für den zitierten Eintrag, in der Originalsprache wiedergegeben. Maßgeblich ist die Fassung der Originalpublikation.

Das Abstract wird nicht übersetzt, damit die eigene Wortwahl der Autoren erhalten bleibt.

Antistasin (ATS), ein 119-Aminosäuren-Protein aus Blutegeln, hemmt Faktor Xa selektiv und festbindend; längere Inkubation spaltete die Peptidbindung Arg34-Val35, die mutmaßliche reaktive Stelle. Modifiziertes (gespaltenes) rekombinantes ATS (rATS) behielt mit Kd = 166,3 ± 9,6 pM (nativer Inhibitor: 43,4 ± 1,4 pM) starke Hemmwirkung. Katalytische Mengen Faktor Xa resynthetisierten die Bindung bis zu einem Gleichgewicht nahe eins; Carboxypeptidase B entfernte das neue C-terminale Arg, verhinderte die Rückumwandlung und hob die Hemmwirkung auf. Die Autoren sehen darin den Standardmechanismus der Serinproteaseinhibitoren bestätigt.

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