Hidrólisis y resíntesis de un único enlace peptídico del sitio reactivo en antistasina recombinante por el factor de coagulación Xa

Antistasin (ATS) is a 119-amino acid, leech-derived protein which exhibits selective, tight-binding inhibition of blood coagulation factor Xa. Prolonged incubation of ATS with factor Xa leads to the highly specific hydrolysis of the peptide bond between residues Arg34 and Val35, implicating this peptide bond as the putative reactive site. We report here the preparation of pure, cleaved (modified) recombinant ATS (rATS) and utilize this material to provide additional proof that the cleaved peptide bond is in fact the reactive site. Modified rATS retains strong inhibitory potency against factor Xa as evidenced by a dissociation constant of 166.3 +/- 9.6 pM; four-fold greater than that of native inhibitor, 43.4 +/- 1.4 pM. Incubation of pure, modified rATS with catalytic amounts of factor Xa results in resynthesis of the hydrolyzed peptide bond, achieving an equilibrium near unity between native and modified inhibitors. Specific removal of the newly formed carboxy-terminal Arg residue from modified rATS by carboxypeptidase B treatment obviates its conversion to native inhibitor coincident with the complete loss of inhibitory activity. These results establish that rATS inhibits factor Xa according to a standard mechanism of serine protease inhibitors and support the contention that the Arg34-Val35 peptide bond constitutes the reactive site.

Resumen tomado de PubMed (NCBI) para el registro citado, en el idioma original. La versión de referencia es la de la publicación original.

El resumen se deja sin traducir para conservar la redacción original de los autores.

La antistasina, proteína de 119 aminoácidos derivada de sanguijuelas, inhibe selectivamente el factor Xa. La antistasina recombinante escindida conservó potente inhibición (constante de disociación de 166,3 ± 9,6 pM frente a 43,4 ± 1,4 pM del inhibidor nativo). Cantidades catalíticas de factor Xa resintetizaron el enlace hidrolizado Arg34-Val35 hasta un equilibrio casi unitario; eliminar la Arg carboxilo-terminal con carboxipeptidasa B abolió la actividad. Según los autores, ello respalda ese sitio reactivo y el mecanismo estándar de inhibidores de serina-proteasas.

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